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凝膠滲透色譜儀之凝膠的選擇和制備

發布時間:2018-07-18瀏覽:1292次
隨著進樣技術和色譜柱接頭設計的改進,現在已經可以得到柱效每米在八萬到十萬的凝膠色譜填料。凝膠色譜填料合成技術的進展主要在下面四個方面:填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學改性的發展。近年來在這方面有較多的新產品,中國也有許多單位在研制和生產。凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的應用面。
(一)凝膠滲透色譜儀層析柱
層析柱是凝膠層析技術中的主體,一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度,樣品用量大,可加大柱的直徑,一般制備用凝膠柱,直徑大于2厘米,但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外,直徑加大,洗脫液體體積增大,樣品稀釋度大。分離度取決于柱高,為分離不同組分,凝膠柱床必須有適宜的高度,分離度與柱高的平方根相關,但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞,一般不超過1米。分族分離時用短柱,一般凝膠柱長20-30厘米,柱高與直徑的比較5:1─10:1,凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1,常用凝膠柱有50×25厘米,10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應盡可能的小,如果支掌濾板下的死體積大,被分離組分之間重新混合的可能性就大,其結果是影響洗脫峰形,出現拖尾出象,降低分辯力。在分離時,死體積不能超過總床體積的1/1000。
(二)凝膠滲透色譜儀凝膠的選擇
根據所需凝膠體積,估計所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍,例如Sephadex G-20的吸水量為20,1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好,但阻力大,流速慢。一般實驗室分離蛋白質采用100-200號篩目的的Sephadex G-200效果好,脫鹽用Sephadex G-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快。
(三)凝凝膠滲透色譜儀膠的制備
商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹,可用加熱法,即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸,這樣可大大中速膨脹,通常在1-2小時內即可完成。特別是在使用軟膠時,自然膨脹需24小時至數天,而用加熱法在幾小時內就可完成。這種方法不但節約時間,而且還可消毒,除去凝膠中污染的細菌和排除膠內的空氣。
(四)凝膠滲透色譜儀樣品溶液的處理
樣品溶液如有沉淀應過濾或離心除去,如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大,含蛋白為超過4%,粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質樣品的體積為凝膠床的1-4%(一般約0.5-2ml),進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10%,在蛋白質溶液除鹽時,樣品可達凝膠床的20-30%。分級分離樣品體積要小,使樣品層盡可能窄,洗脫出的峰形較好。
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